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本制品是基于可视化RT-LMAP技术开发的简单快捷的烟草花叶病毒检测试剂盒。

烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)属于植物杆状病毒科烟草花叶病毒属，为正义单链RNA病毒，基因组全长为6395nt。烟草花叶病毒的传染性和存活率比较高，在自然界中主要通过汁液摩擦传播，同时也通过蚜虫、土壤以及种子传播，不同寄主被侵染后表现出不同的症状，侵染烟草时表现出黄绿相间的花叶症状，严重时形成疱斑，被侵染烟草的烟叶产量和品质会受到明显影响。烟草花叶病毒对烟草、黄瓜、辣椒和观赏植物等125种植物造成了巨大的损害。因此，快速检测烟草花叶病毒具有重要的意义。

1. 即开即用，用户只需要提供RNA样品。
   
2. 恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
   
3. 检测灵敏度一般比RT-PCR高10倍以上。
   
4. 特异性高，根据烟草花叶病毒保守序列设计6条特异引物，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
   
5. 一般30分钟内出结果，比PCR快。
   
6. 上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到14μL。
   
7. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
   
8. 本制品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
   
9. 本制品足够50次20μL体系的可视化RT-LAMP扩增。
   
10. 本制品只可用于科研。

1. 用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PC)和一个样品制备阴性对照(NC)。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照(10⁴拷贝/μL)加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

3. 反应设置：第一次使用时请把所有逆转录酶-扩增酶混合液(50μL，本试剂盒提供)加入到4×Visual RT-LAMP MasterMix中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP扩增阳性对照和RT-LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	RT-LAMP 阴性对照	RT-LAMP 阳性对照
   4×Visual RT-LAMP MasterMix(已加酶)	各5μL	5μL	5μL
   20×烟草花叶病毒LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
   N+2个样品RNA	各14μL	不加	不加
   超纯水	不加	14μL	不加
   烟草花叶病毒阳性对照(104拷贝/μL)	不加	不加	14μL

4. 使用常规PCR仪进行LAMP反应，设置程序时必须打开热盖，设置成65℃保温60分钟进行扩增。

5. 电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL RT-LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-LAMP阳性对照必须有正常RT-LAMP条带(200bp左右的梯形扩增产物)，RT-LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果RT-LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：
   
   
6. 可将光(肉眼)分析：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图(9为阴性，10为阳性)。